Our ITC experiments directly demonstrate that assembly of hmcpn10 and Aacpn10-del25 is accompanied by:
unfavorable (i.e., endothermic) enthalpy (98 and 186 kJ/mol, respectively)
and favorable (i.e., positive) entropy (420 and 730 J/mol,K, respectively).
The overall enthalpy change may include three major terms:
1) conformational enthalpy;
2) interaction enthalpy; and
3) solvation enthalpy (23).
Conformational enthalpy is generally exothermic since formation of secondary structure is favorable; however, since the cpn10 monomers are probably folded in solution (14), this term will be negligible.
The second term is also exothermic, since it involves the formation of new noncovalent interactions such as electrostatic attraction, van der Waals interactions, and hydrogen bonds (23).
Since the overall enthalpy change is endothermic in the case of cpn10, the second term is likely compensated for by a large positive third term, which involves the release of ordered water molecules from the monomer surfaces that form the interfaces. This reaction is enthalpically unfavorable since it involves the breakage of hydrogen and ionic bonds.
The positive entropy associated with cpn10 assembly follows the classical hydrophobic effect, which is an entropy-driven process. Partitioning of a nonpolar molecule from water to a nonpolar phase is accompanied by an increase in the entropy of the system (24). Since the cpn10 interfaces are mostly hydrophobic, there may be a significant number of ordered waters released upon assembly. Thus, both the favorable entropy and the unfavorable enthalpy can be explained by a release of ordered water molecules upon heptamer assembly.
An alternative source for endothermic enthalpy and positive entropy accompanying association is the idea of structural loosening of the monomer structure (25).
This phenomenon has been shown to correspond to endothermic enthalpies and positive entropies and several biological examples have been reported (e.g., peptide-membrane interactions (25) and complex formation between metalloprotease inhibitor N-TIMP-1 and stromelysin 1 (26)).
unfavorable (i.e., endothermic) enthalpy (98 and 186 kJ/mol, respectively)
and favorable (i.e., positive) entropy (420 and 730 J/mol,K, respectively).
The overall enthalpy change may include three major terms:
1) conformational enthalpy;
2) interaction enthalpy; and
3) solvation enthalpy (23).
Conformational enthalpy is generally exothermic since formation of secondary structure is favorable; however, since the cpn10 monomers are probably folded in solution (14), this term will be negligible.
The second term is also exothermic, since it involves the formation of new noncovalent interactions such as electrostatic attraction, van der Waals interactions, and hydrogen bonds (23).
Since the overall enthalpy change is endothermic in the case of cpn10, the second term is likely compensated for by a large positive third term, which involves the release of ordered water molecules from the monomer surfaces that form the interfaces. This reaction is enthalpically unfavorable since it involves the breakage of hydrogen and ionic bonds.
The positive entropy associated with cpn10 assembly follows the classical hydrophobic effect, which is an entropy-driven process. Partitioning of a nonpolar molecule from water to a nonpolar phase is accompanied by an increase in the entropy of the system (24). Since the cpn10 interfaces are mostly hydrophobic, there may be a significant number of ordered waters released upon assembly. Thus, both the favorable entropy and the unfavorable enthalpy can be explained by a release of ordered water molecules upon heptamer assembly.
An alternative source for endothermic enthalpy and positive entropy accompanying association is the idea of structural loosening of the monomer structure (25).
This phenomenon has been shown to correspond to endothermic enthalpies and positive entropies and several biological examples have been reported (e.g., peptide-membrane interactions (25) and complex formation between metalloprotease inhibitor N-TIMP-1 and stromelysin 1 (26)).
Наши эксперименты ITC напрямую демонстрируют, что сборка hmcpn10 и Aacpn10-del25 сопровождается:
неблагоприятной (т. е. эндотермической) энтальпией (98 и 186 кДж/моль соответственно) и
благоприятной (т. е. положительной) энтропией (420 и 730 Дж/моль,К соответственно).
Общее изменение энтальпии может включать три основных члена:
1) конформационная энтальпия;
2) энтальпия взаимодействия; и
3) энтальпия сольватации (23).
Конформационная энтальпия, как правило, экзотермична, поскольку благоприятно образование вторичной структуры; однако, поскольку мономеры cpn10, вероятно, сворачиваются в растворе (14), этот член будет пренебрежимо мал. Второй член также экзотермичен, поскольку он включает образование новых нековалентных взаимодействий, таких как электростатическое притяжение, ван-дер-ваальсовы взаимодействия и водородные связи (23).
Поскольку общее изменение энтальпии является эндотермическим в случае cpn10, второй член, вероятно, компенсируется большим положительным третьим членом, который включает в себя высвобождение упорядоченных молекул воды с поверхностей мономеров, которые образуют интерфейсы.
Эта реакция энтальпически невыгодна, поскольку она включает в себя разрыв водородных и ионных связей.
Положительная энтропия, связанная со сборкой cpn10, следует классическому гидрофобному эффекту, который является процессом, управляемым энтропией.
Разделение неполярной молекулы из воды в неполярную фазу сопровождается увеличением энтропии системы (24).
Поскольку интерфейсы cpn10 в основном гидрофобны, при сборке может выделяться значительное количество упорядоченной воды. Таким образом, как благоприятная энтропия, так и неблагоприятная энтальпия могут быть объяснены высвобождением упорядоченных молекул воды при сборке гептамера.
Альтернативным источником эндотермической энтальпии и положительной энтропии, сопровождающей ассоциацию, является идея структурного ослабления структуры мономера (25). Было показано, что это явление соответствует эндотермическим энтальпиям и положительным энтропиям, и было описано несколько биологических примеров (например, пептидно-мембранные взаимодействия (25) и комплексообразование между ингибитором металлопротеазы N-TIMP-1 и стромелизином 1
неблагоприятной (т. е. эндотермической) энтальпией (98 и 186 кДж/моль соответственно) и
благоприятной (т. е. положительной) энтропией (420 и 730 Дж/моль,К соответственно).
Общее изменение энтальпии может включать три основных члена:
1) конформационная энтальпия;
2) энтальпия взаимодействия; и
3) энтальпия сольватации (23).
Конформационная энтальпия, как правило, экзотермична, поскольку благоприятно образование вторичной структуры; однако, поскольку мономеры cpn10, вероятно, сворачиваются в растворе (14), этот член будет пренебрежимо мал. Второй член также экзотермичен, поскольку он включает образование новых нековалентных взаимодействий, таких как электростатическое притяжение, ван-дер-ваальсовы взаимодействия и водородные связи (23).
Поскольку общее изменение энтальпии является эндотермическим в случае cpn10, второй член, вероятно, компенсируется большим положительным третьим членом, который включает в себя высвобождение упорядоченных молекул воды с поверхностей мономеров, которые образуют интерфейсы.
Эта реакция энтальпически невыгодна, поскольку она включает в себя разрыв водородных и ионных связей.
Положительная энтропия, связанная со сборкой cpn10, следует классическому гидрофобному эффекту, который является процессом, управляемым энтропией.
Разделение неполярной молекулы из воды в неполярную фазу сопровождается увеличением энтропии системы (24).
Поскольку интерфейсы cpn10 в основном гидрофобны, при сборке может выделяться значительное количество упорядоченной воды. Таким образом, как благоприятная энтропия, так и неблагоприятная энтальпия могут быть объяснены высвобождением упорядоченных молекул воды при сборке гептамера.
Альтернативным источником эндотермической энтальпии и положительной энтропии, сопровождающей ассоциацию, является идея структурного ослабления структуры мономера (25). Было показано, что это явление соответствует эндотермическим энтальпиям и положительным энтропиям, и было описано несколько биологических примеров (например, пептидно-мембранные взаимодействия (25) и комплексообразование между ингибитором металлопротеазы N-TIMP-1 и стромелизином 1
Analyzing Protein Thermal Stability
As described in the DSC Overview Note, analyzing the stability of a protein in dilute solution involves determining changes in the partial molar heat capacity of the protein at constant pressure.
The change in heat capacity (ΔCp) of a compound reflects its ability to absorb heat and experience a defined increase in temperature. Because of its extensive hydrogen bond network, water has a substantially higher heat capacity than organic compounds such as proteins.
In addition, water is more ordered and tightly packed adjacent to hydrophobic patches on the protein’s surface: since water cannot make hydrogen bonds to nonpolar moieties, hydrogen bonding between water molecules is maximized (clathrate formation) at the protein-solvent interface (Shinoda, 1977).
As the temperature is raised, the ordered water shell around the protein starts to disorder and become more like bulk water.
This ‘melting’ produces the anomalously large heat capacity of protein aqueous solutions. The contribution of the protein to the calorimetrically measured heat capacity (its partial Cp) is p determined by subtracting a scan of a buffer blank from the sample data prior to analysis.
The partial Cp is not just the heat capacity of the protein, but also includes any effects the protein had on the solvent, such as promoting clathrate formation (Freire, 1995).
Heating the protein sample initially produces a slightly increasing baseline but as heating progresses, heat is absorbed by the protein and causes it to thermally unfold over a temperature range characteristic for that protein, giving rise to an endothermic peak (Fig. 1 ).
During the unfolding process, water molecules around the protein reorganize and restructure as more non-polar sidechains are exposed. Once unfolding is complete, heat absorption decreases, and a new baseline is established.
As described in the DSC Overview Note, analyzing the stability of a protein in dilute solution involves determining changes in the partial molar heat capacity of the protein at constant pressure.
The change in heat capacity (ΔCp) of a compound reflects its ability to absorb heat and experience a defined increase in temperature. Because of its extensive hydrogen bond network, water has a substantially higher heat capacity than organic compounds such as proteins.
In addition, water is more ordered and tightly packed adjacent to hydrophobic patches on the protein’s surface: since water cannot make hydrogen bonds to nonpolar moieties, hydrogen bonding between water molecules is maximized (clathrate formation) at the protein-solvent interface (Shinoda, 1977).
As the temperature is raised, the ordered water shell around the protein starts to disorder and become more like bulk water.
This ‘melting’ produces the anomalously large heat capacity of protein aqueous solutions. The contribution of the protein to the calorimetrically measured heat capacity (its partial Cp) is p determined by subtracting a scan of a buffer blank from the sample data prior to analysis.
The partial Cp is not just the heat capacity of the protein, but also includes any effects the protein had on the solvent, such as promoting clathrate formation (Freire, 1995).
Heating the protein sample initially produces a slightly increasing baseline but as heating progresses, heat is absorbed by the protein and causes it to thermally unfold over a temperature range characteristic for that protein, giving rise to an endothermic peak (Fig. 1 ).
During the unfolding process, water molecules around the protein reorganize and restructure as more non-polar sidechains are exposed. Once unfolding is complete, heat absorption decreases, and a new baseline is established.
Анализ термической стабильности белка
Как описано в обзорной заметке DSC, анализ стабильности белка в разбавленном растворе включает определение изменений парциальной молярной теплоемкости белка при постоянном давлении (ΔCp).
Изменение теплоемкости соединения отражает его способность поглощать тепло и испытывать определенное повышение температуры. Из-за своей обширной сети водородных связей вода имеет существенно более высокую теплоемкость, чем органические соединения, такие как белки. Кроме того, вода более упорядочена и плотно упакована рядом с гидрофобными участками на поверхности белка: поскольку вода не может образовывать водородные связи с неполярными фрагментами, водородные связи между молекулами воды максимизируются (образование клатрата) на границе раздела белок-растворитель (Шинода, 1977).
По мере повышения температуры упорядоченная водная оболочка вокруг белка начинает разупорядочиваться и становится больше похожей на объемную воду. Это «плавление» создает аномально большую теплоемкость водных растворов белка. Вклад белка в калориметрически измеренную теплоемкость (его парциальный Cp) определяется путем вычитания сканирования буферного бланка из данных образца перед анализом.
Парциальный Cp - это не только теплоемкость белка, но и любые эффекты, которые белок оказал на растворитель, такие как содействие образованию клатрата (Freire, 1995). Нагревание образца белка изначально приводит к слегка увеличивающейся базовой линии, но по мере нагревания тепло поглощается белком и заставляет его термически разворачиваться в диапазоне температур, характерном для этого белка, что приводит к появлению эндотермического пика (рис. 1). В процессе разворачивания молекулы воды вокруг белка реорганизуются и реструктурируются по мере того, как обнажается больше неполярных боковых цепей. После завершения разворачивания поглощение тепла уменьшается, и устанавливается новая базовая линия.
Как описано в обзорной заметке DSC, анализ стабильности белка в разбавленном растворе включает определение изменений парциальной молярной теплоемкости белка при постоянном давлении (ΔCp).
Изменение теплоемкости соединения отражает его способность поглощать тепло и испытывать определенное повышение температуры. Из-за своей обширной сети водородных связей вода имеет существенно более высокую теплоемкость, чем органические соединения, такие как белки. Кроме того, вода более упорядочена и плотно упакована рядом с гидрофобными участками на поверхности белка: поскольку вода не может образовывать водородные связи с неполярными фрагментами, водородные связи между молекулами воды максимизируются (образование клатрата) на границе раздела белок-растворитель (Шинода, 1977).
По мере повышения температуры упорядоченная водная оболочка вокруг белка начинает разупорядочиваться и становится больше похожей на объемную воду. Это «плавление» создает аномально большую теплоемкость водных растворов белка. Вклад белка в калориметрически измеренную теплоемкость (его парциальный Cp) определяется путем вычитания сканирования буферного бланка из данных образца перед анализом.
Парциальный Cp - это не только теплоемкость белка, но и любые эффекты, которые белок оказал на растворитель, такие как содействие образованию клатрата (Freire, 1995). Нагревание образца белка изначально приводит к слегка увеличивающейся базовой линии, но по мере нагревания тепло поглощается белком и заставляет его термически разворачиваться в диапазоне температур, характерном для этого белка, что приводит к появлению эндотермического пика (рис. 1). В процессе разворачивания молекулы воды вокруг белка реорганизуются и реструктурируются по мере того, как обнажается больше неполярных боковых цепей. После завершения разворачивания поглощение тепла уменьшается, и устанавливается новая базовая линия.
After blank subtraction, the data can be analyzed to provide a complete thermodynamic characterization of the unfolding process. Integration of the heat capacity of the sample vs. temperature yields the enthalpy (ΔH)
После вычитания пустых значений данные можно проанализировать, чтобы получить полную термодинамическую характеристику процесса разворачивания. Интеграция теплоемкости образца в зависимости от температуры дает энтальпию (ΔH)
процесса разворачивания, который происходит из-за эндотермических событий, таких как разрыв водородных связей, и экзотермических процессов, таких как нарушение гидрофобных взаимодействий (Bruylants et al., 2005). Сдвиг базовой линии до и после перехода представляет собой изменение теплоемкости (ΔCp) белка (и связанной воды), вызванное разворачиванием. Средняя точка перехода (Tm, или температура плавления) — это температура, при которой половина молекул белка сворачивается, а половина — развертывается. Энтропия (ΔS) получается из площади под кривой Cp/T от T.
of the unfolding process, which is due to endothermic events such as the breaking of hydrogen bonds, and exothermic processes such as the disruption of hydrophobic interactions (Bruylants et al., 2005). The shift in baseline before and after the transition represents the change in heat capacity (ΔCp of the protein (and associated water) caused by unfolding. The transition midpoint (Tm, or the melting temperature) is the temperature at which half the protein molecules are folded and half are unfolded. The entropy (ΔS) is obtained from the area under the curve of Cp/T vs. T.
Establishing the reversibility of the unfolding reaction is not necessary if only the determination of Tm is of interest.
However, a full thermodynamic characterization of the unfolding event requires that the reversibility of the unfolding transition be verified (Marky and Breslauer, 1987).
This is accomplished by rescanning the sample under identical conditions and obtaining a second endotherm that is superimposable on the first. Irreversibility, if observed, may be due to a second (irreversible) unfolding event occurring after the first (reversible) unfolding transition at Tm.
The capillary cells in the DSC delay the onset of irreversible protein aggregation and precipitation, allowing a complete, interpretable scan to be obtained on essentially any sample. For example, 100 μM bovine serum albumin (in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.2, scanned from 20 to 90 °C at 1 °C/min) precipitated after a single scan, whereas under identical conditions precipitate was not observed below 300 μMin in the DSC (capillary cells).
However, a full thermodynamic characterization of the unfolding event requires that the reversibility of the unfolding transition be verified (Marky and Breslauer, 1987).
This is accomplished by rescanning the sample under identical conditions and obtaining a second endotherm that is superimposable on the first. Irreversibility, if observed, may be due to a second (irreversible) unfolding event occurring after the first (reversible) unfolding transition at Tm.
The capillary cells in the DSC delay the onset of irreversible protein aggregation and precipitation, allowing a complete, interpretable scan to be obtained on essentially any sample. For example, 100 μM bovine serum albumin (in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.2, scanned from 20 to 90 °C at 1 °C/min) precipitated after a single scan, whereas under identical conditions precipitate was not observed below 300 μMin in the DSC (capillary cells).
Установление обратимости реакции разворачивания не является необходимым, если интерес представляет только определение Tm. Однако полная термодинамическая характеристика события разворачивания требует проверки обратимости перехода разворачивания (Marky и Breslauer, 1987).
Это достигается путем повторного сканирования образца в идентичных условиях и получения второй эндотермы, которая накладывается на первую. Необратимость, если она наблюдается, может быть вызвана вторым (необратимым) событием разворачивания, происходящим после первого (обратимого) перехода разворачивания при Tm.
Капиллярные ячейки в DSC задерживают начало необратимой агрегации и осаждения белка, что позволяет получить полное, интерпретируемое сканирование практически для любого образца. Например, 100 мкМ бычьего сывороточного альбумина (в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,2, сканированном от 20 до 90 °C со скоростью 1 °C/мин) выпадал в осадок после однократного сканирования, тогда как при идентичных условиях в ДСК (капиллярные ячейки) осадок не наблюдался ниже 300 мкМ.
Это достигается путем повторного сканирования образца в идентичных условиях и получения второй эндотермы, которая накладывается на первую. Необратимость, если она наблюдается, может быть вызвана вторым (необратимым) событием разворачивания, происходящим после первого (обратимого) перехода разворачивания при Tm.
Капиллярные ячейки в DSC задерживают начало необратимой агрегации и осаждения белка, что позволяет получить полное, интерпретируемое сканирование практически для любого образца. Например, 100 мкМ бычьего сывороточного альбумина (в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,2, сканированном от 20 до 90 °C со скоростью 1 °C/мин) выпадал в осадок после однократного сканирования, тогда как при идентичных условиях в ДСК (капиллярные ячейки) осадок не наблюдался ниже 300 мкМ.
The sharpness of the transition peak is indicative of the cooperative nature of the unfolding process. If unfolding produces a narrow, relatively symmetric peak such as in Fig. 2, the transition is likely to be two-state, reversible and highly cooperative (Bruyants et al., 2005).
This is often the situation for small, single domain proteins; Two-state behavior can be verified by fitting the curve to the two-state van’t Hoff equation; this calculation is performed by software supplied with DSC.
The van’t Hoff enthalpy obtained (ΔHvH) can be different from the calorimetric enthalpy since the latter includes all contributions from the sample, including solvent rearrangement. If the van’t Hoff and calorimetric enthalpies are the same, the denaturation process may be accurately approximated by the two-state model. If the van’t Hoff enthalpy is smaller than the calorimetric enthalpy, an unfolding intermediate is likely formed, while if it is larger than the calorimetric enthalpy, the protein is likely multimeric (Marky and Breslauer, 1987).
This is often the situation for small, single domain proteins; Two-state behavior can be verified by fitting the curve to the two-state van’t Hoff equation; this calculation is performed by software supplied with DSC.
The van’t Hoff enthalpy obtained (ΔHvH) can be different from the calorimetric enthalpy since the latter includes all contributions from the sample, including solvent rearrangement. If the van’t Hoff and calorimetric enthalpies are the same, the denaturation process may be accurately approximated by the two-state model. If the van’t Hoff enthalpy is smaller than the calorimetric enthalpy, an unfolding intermediate is likely formed, while if it is larger than the calorimetric enthalpy, the protein is likely multimeric (Marky and Breslauer, 1987).
Correlating Thermodynamic Properties to Stability
The stability of a protein (and hence its Tm) depends on environmental conditions. For example, a protein will be optimally stable at a characteristic pH and will be destabilized at pH values deviating from that optimum (Privalov and Khechinashvili, 1974).
The conformational stability of a protein may be affected by its concentration (showing the importance of protein-protein interactions), ionic strength of the solution (showing the role of electrostatic interactions) and scan rate (showing that thermal denaturation has a kinetic component).
A complete thermodynamic characterization of a simple protein such as lysozyme illustrates the complex interplay of stabilizing and destabilizing interactions and shows that lysozyme is unusually stable for a small protein (Pfeil and Privalov, 1976; Griko et al., 1995).
The different heat capacities of the folded and denatured form of the protein show that the enthalpies and entropies of both states are strongly temperature dependent, but they largely compensate each other so that the net stability of a typical small protein is approximately 80-120 kJ/mol (20-30 kcal/mol).
The large ΔCp of unfolding also indicates p that a protein will have maximum stability at a given temperature (depending on its sequence, pH, etc.), and that its net stability will decrease above and below that temperature. Thus, proteins can not only be denatured by heating but can also be denatured by cooling.
The conformational stability of a protein may be affected by its concentration (showing the importance of protein-protein interactions), ionic strength of the solution (showing the role of electrostatic interactions) and scan rate (showing that thermal denaturation has a kinetic component).
A complete thermodynamic characterization of a simple protein such as lysozyme illustrates the complex interplay of stabilizing and destabilizing interactions and shows that lysozyme is unusually stable for a small protein (Pfeil and Privalov, 1976; Griko et al., 1995).
The different heat capacities of the folded and denatured form of the protein show that the enthalpies and entropies of both states are strongly temperature dependent, but they largely compensate each other so that the net stability of a typical small protein is approximately 80-120 kJ/mol (20-30 kcal/mol).
The large ΔCp of unfolding also indicates p that a protein will have maximum stability at a given temperature (depending on its sequence, pH, etc.), and that its net stability will decrease above and below that temperature. Thus, proteins can not only be denatured by heating but can also be denatured by cooling.
Стабильность белка (и, следовательно, его Tm) зависит от условий окружающей среды. Например, белок будет оптимально стабилен при характерном pH и будет дестабилизирован при значениях pH, отклоняющихся от этого оптимума (Привалов и Хечинашвили, 1974).
На конформационную стабильность белка может влиять его концентрация (показывая важность белок-белковых взаимодействий), ионная сила раствора (показывая роль электростатических взаимодействий) и скорость сканирования (показывая, что термическая денатурация имеет кинетическую составляющую).
Полная термодинамическая характеристика простого белка, такого как лизоцим, иллюстрирует сложное взаимодействие стабилизирующих и дестабилизирующих взаимодействий и показывает, что лизоцим необычайно стабилен для небольшого белка (Пфейл и Привалов, 1976; Грико и др., 1995).
Различная теплоемкость свернутой и денатурированной формы белка показывает, что энтальпии и энтропии обоих состояний сильно зависят от температуры, но они в значительной степени компенсируют друг друга, так что чистая стабильность типичного небольшого белка составляет приблизительно 80-120 кДж/моль (20-30 ккал/моль).
Большое значение ΔCp разворачивания также указывает на то, что белок будет иметь максимальную стабильность при данной температуре (в зависимости от его последовательности, pH и т. д.), и что его чистая стабильность будет уменьшаться выше и ниже этой температуры. Таким образом, белки могут быть денатурированы не только нагреванием, но и охлаждением.
На конформационную стабильность белка может влиять его концентрация (показывая важность белок-белковых взаимодействий), ионная сила раствора (показывая роль электростатических взаимодействий) и скорость сканирования (показывая, что термическая денатурация имеет кинетическую составляющую).
Полная термодинамическая характеристика простого белка, такого как лизоцим, иллюстрирует сложное взаимодействие стабилизирующих и дестабилизирующих взаимодействий и показывает, что лизоцим необычайно стабилен для небольшого белка (Пфейл и Привалов, 1976; Грико и др., 1995).
Различная теплоемкость свернутой и денатурированной формы белка показывает, что энтальпии и энтропии обоих состояний сильно зависят от температуры, но они в значительной степени компенсируют друг друга, так что чистая стабильность типичного небольшого белка составляет приблизительно 80-120 кДж/моль (20-30 ккал/моль).
Большое значение ΔCp разворачивания также указывает на то, что белок будет иметь максимальную стабильность при данной температуре (в зависимости от его последовательности, pH и т. д.), и что его чистая стабильность будет уменьшаться выше и ниже этой температуры. Таким образом, белки могут быть денатурированы не только нагреванием, но и охлаждением.
Fig. 3. Temperature scan, converted to molar heat capacity, for hen egg white lysozyme solution in 0.2 M glycine buffer, pH 4.0. Lysozyme concentrations ranged from 400 μg to 2 μg in the 300 μl sample cell. Curves are offset to aid presentation. Data were obtained using a scan rate of 2 °C/min on a DSC
The amount of protein available for characterization can be very limited, which in the past restricted the application of biophysical techniques such as DSC. Recent advances in instrument sensitivity have alleviated this constraint by significantly decreasing the amount of sample required for DSC analyses. Fig. 3 shows raw data for lysozyme scanned on a DSC.
Protein amounts ranged from 400 μg to 2 μg in the 300 μL sample cell. Thermodynamic parameters obtained at all concentrations are consistent (Table 1), showing that even 2 μg of protein can be sufficient to allow accurate thermodynamic characterization of a protein.
Can the thermodynamic properties of a protein, analyzed by DSC, be correlated to structure and stability? As more proteins are carefully characterized both experimentally and computationally, correlations between thermodynamics and structure are being revealed, albeit not yet at a reliably predictive level. A discussion of the stabilizing and destabilizing interactions outlined above comprises a vast body of literature; much of this literature has been rigorously and comprehensively reviewed by Robertson and Murphy (1997).
Protein amounts ranged from 400 μg to 2 μg in the 300 μL sample cell. Thermodynamic parameters obtained at all concentrations are consistent (Table 1), showing that even 2 μg of protein can be sufficient to allow accurate thermodynamic characterization of a protein.
Can the thermodynamic properties of a protein, analyzed by DSC, be correlated to structure and stability? As more proteins are carefully characterized both experimentally and computationally, correlations between thermodynamics and structure are being revealed, albeit not yet at a reliably predictive level. A discussion of the stabilizing and destabilizing interactions outlined above comprises a vast body of literature; much of this literature has been rigorously and comprehensively reviewed by Robertson and Murphy (1997).
Количество белка, доступного для характеристики, может быть очень ограничено, что в прошлом ограничивало применение биофизических методов, таких как ДСК. Недавние достижения в чувствительности приборов смягчили это ограничение, значительно уменьшив количество образца, требуемого для анализа ДСК. На рис. 3 показаны необработанные данные для лизоцима, сканированного на ДСК. Количество белка варьировалось от 400 мкг до 2 мкг в ячейке образца объемом 300 мкл. Термодинамические параметры, полученные при всех концентрациях, являются согласованными (таблица 1), показывая, что даже 2 мкг белка может быть достаточно для точной термодинамической характеристики белка.
Могут ли термодинамические свойства белка, проанализированные с помощью ДСК, коррелироваться со структурой и стабильностью? Поскольку все больше белков тщательно характеризуются как экспериментально, так и вычислительно, выявляются корреляции между термодинамикой и структурой, хотя пока и не на надежно предсказательном уровне. Обсуждение стабилизирующих и дестабилизирующих взаимодействий, описанных выше, охватывает обширный объем литературы; Большая часть этой литературы была тщательно и всесторонне проанализирована Робертсоном и Мерфи (1997).
Могут ли термодинамические свойства белка, проанализированные с помощью ДСК, коррелироваться со структурой и стабильностью? Поскольку все больше белков тщательно характеризуются как экспериментально, так и вычислительно, выявляются корреляции между термодинамикой и структурой, хотя пока и не на надежно предсказательном уровне. Обсуждение стабилизирующих и дестабилизирующих взаимодействий, описанных выше, охватывает обширный объем литературы; Большая часть этой литературы была тщательно и всесторонне проанализирована Робертсоном и Мерфи (1997).
Table 1. Thermodyanamic parameters obtained from the lysozyme scans presented in Figure 3.
The thermodynamic balance in proteins is delicate:
the folded structure of a small protein is stabilized by approximately 80‑120 kJ/mol (20-30 kcal/ mol) compared to its unfolded structure, and many proteins thermally unfold by 70 °C.
If most proteins can be denatured by relatively small increases in temperature, and if the balance between folded and unfolded states is held by the equivalent of 5 – 8 hydrogen bonds, how are thermophilic proteins stabilized, allowing organisms to thrive at elevated pressures and at temperatures above 100 °C ?
In the absence of thermal changes, what thermodynamic events trigger proteins that cause amyloid and prion diseases to switch from one stable conformation to another, with fatal consequences ?
the folded structure of a small protein is stabilized by approximately 80‑120 kJ/mol (20-30 kcal/ mol) compared to its unfolded structure, and many proteins thermally unfold by 70 °C.
If most proteins can be denatured by relatively small increases in temperature, and if the balance between folded and unfolded states is held by the equivalent of 5 – 8 hydrogen bonds, how are thermophilic proteins stabilized, allowing organisms to thrive at elevated pressures and at temperatures above 100 °C ?
In the absence of thermal changes, what thermodynamic events trigger proteins that cause amyloid and prion diseases to switch from one stable conformation to another, with fatal consequences ?
Термодинамический баланс в белках является деликатным:
складчатая структура небольшого белка стабилизируется примерно на 80–120 кДж/моль (20–30 ккал/моль) по сравнению с его развернутой структурой, и многие белки термически разворачиваются при 70 °C.
Если большинство белков могут быть денатурированы при относительно небольшом повышении температуры, и если баланс между свернутым и развернутым состояниями поддерживается эквивалентом 5–8 водородных связей, как стабилизируются термофильные белки, позволяя организмам процветать при повышенном давлении и при температуре выше 100 °C (Perl and Schmid, 2002)?
При отсутствии термических изменений, какие термодинамические события запускают белки, вызывающие амилоидные и прионные заболевания, чтобы перейти из одной стабильной конформации в другую, что приводит к фатальным последствиям ?
складчатая структура небольшого белка стабилизируется примерно на 80–120 кДж/моль (20–30 ккал/моль) по сравнению с его развернутой структурой, и многие белки термически разворачиваются при 70 °C.
Если большинство белков могут быть денатурированы при относительно небольшом повышении температуры, и если баланс между свернутым и развернутым состояниями поддерживается эквивалентом 5–8 водородных связей, как стабилизируются термофильные белки, позволяя организмам процветать при повышенном давлении и при температуре выше 100 °C (Perl and Schmid, 2002)?
При отсутствии термических изменений, какие термодинамические события запускают белки, вызывающие амилоидные и прионные заболевания, чтобы перейти из одной стабильной конформации в другую, что приводит к фатальным последствиям ?
